摘要: 目的:构建人胱抑素C(Cystatin C,CysC)基因的原表达质粒pCold TF-CysC,表达TF-CysC融合蛋白,并制备去标签蛋白的CysC。 方法:用人CysC的全长编码基因插入原核表达载体pCold TF并测序鉴定。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱纯化后获得带有His标签的重组蛋白TF-CysC。利用GST-HRV 3C蛋白酶酶切去除该融合蛋白的TF标签,再经分子筛一步法同时去除TF标签、3C蛋白酶获得CysC,SDS-PAGE鉴定其纯度。用所获无标签CysC免疫新西兰大白兔,制备抗血清,并用间接ELISA及Western blot鉴定。结果: 测序获得序列与Genbank中人CysC序列一致,实现了CysC可溶性高表达。纯化的无蛋白标签的CysC纯度大于95%,分子量约为13.3 kD,与预期相符。免疫家兔后,获得的抗血清效价达到1:4×106以上,并能特异性识别商用CysC蛋白。该蛋白稳定性良好,在4℃保存一个月未见明显下降。结论:成功应用原核表达系统获得去融合蛋白标签的CysC,为进一步建立CysC的免疫检测方法奠定了基础。
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