中国药学杂志

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    单克隆抗体药物分析方法验证专栏
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    定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证
    武刚, 付志浩, 杨志行, 崔永霏, 张荣建, 宗伟英, 王兰
    2019, 54(24): 2001-2009. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.001
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    目的 NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法 针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列: CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列: FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL-1～300 pg·μL-1内,线性良好(r2＞0.99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均＜15%;定量限为3 fg·μL-1;内部参考品 DNA 标定结果为30 μg·mL-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组 DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%～130%,RSD均＜15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均＜30%。结论 自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主 DNA 残留检测要求。

  • 单克隆抗体药物分析方法验证专栏
    基于实验设计的抗PD-1/PD-L1单抗报告基因抗体依赖细胞介导的细胞毒效应生物学活性优化及验证方法的建立
    刘春雨, 于传飞, 崔永霏, 肖启东, 黄璟, 王兰
    2019, 54(24): 2010-2017. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.002
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    目的 利用实验设计(design of experiment,DOE)建立抗程序性死亡因子1(programmed cell death 1,PD-1)及其配体(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单抗基于报告基因的抗体依赖细胞介导的细胞毒效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)生物学活性优化及验证方法。方法 利用Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,分别以293FT-PD-1细胞系和CHO-PD-L1细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BrightGloTMLuciferase Assay system)建立抗PD-1/PD-L1单抗的ADCC生物学活性检测方法,并运用DOE方法进行试验优化和方法学验证。结果 抗PD-1/PD-L1单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/+D,方法经优化后确定抗体量效范围分别为10 000~4.833 ng·mL-1和2 000~0.488 ng·mL-1,效靶比(effect target ratio, E∶T)为分别为6∶1和3∶1,诱导时间均为20 h。该方法具有良好的专属性;抗PD-1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(51.74±2.22)%、(77.12±3.14)%、(118.71±2.83)%和(156.20±12.99)%;对应的回收率分别为(103.49±4.44)%、(102.83±4.19)%、(94.96±2.26)%和(104.14±8.66)%,抗PD-L1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(54.32±4.75)%、(75.24±4.25)%、(127.40±2.43)%和(156.82±3.27)%;对应的回收率分别为(108.64±9.51)%、(100.33±5.67)%、(101.92±1.94)%和(104.55±2.18)%,上述结果的RSD均小于10%。结论 本实验利用DOE设计成功建立基于报告基因的抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的优化及验证方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的评价方法。
  • 单克隆抗体药物分析方法验证专栏
    以Delta样蛋白3为靶点的抗体偶联药物质量研究
    李萌, 孙亮, 朱磊, 于传飞, 王文波, 武刚, 张荣建, 崔永霏, 王兰
    2019, 54(24): 2018-2027. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.004
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    目的 建立一种基于半胱氨酸偶联方式的抗体偶联药物抗Delta样蛋白3(DLL3)单抗-MPVP-PBD的质控方法。方法 本实验利用转基因细胞法,以转染了DLL3的HEK 293T细胞系为靶细胞测定抗DLL3单抗-MPVP-PBD的生物学活性;利用ELISA法测定结合活性;利用CE-SDS和SEC-UPLC测定大小异质性;利用iCIEF分析电荷异质性;分别利用HIC-HPLC和LC-MS对药物抗体偶联比(drug-to-antibody ratio,DAR)进行测定;利用RP-HPLC测定游离小分子药物含量。结果 抗DLL3单抗-MPVP-PBD的生物学活性EC50平均值为(4.02±0.22)ng·mL-1,RSD为5.47%;结合活性EC50平均值为(12.67±1.09)ng·mL-1,RSD为8.60%;非还原CE-SDS 完整IgG峰面积百分比为(25.58±0.15)%、HHL为(36.56±0.24)%、轻链为(14.61±0.13)%等,RSD均小于2%;还原CE-SDS 重链和轻链峰面积之和为(96.97±0.31)%,RSD为0.32%;SEC-UPLC主峰面积为(98.68±0.05)%,多聚体(1.32±0.05)%,RSD均小于5%;iCIEF 主峰面积为(68.19±0.68)%,主峰等电点(8.28±0.01),RSD均小于2%;LC-MS测定DAR为2.08(完整相对分子质量水平)和1.73(轻重链水平);HIC-HPLC测定DAR为(1.86±0.03),0-药物为(19.49±0.28)%,1-药物为(11.21±0.20)%,2-药物为(48.64±0.68)%,3-药物为(5.21±0.40)%,4-药物为(15.44±1.19)%,RSD均小于10%; LC-MS测定了偶联位点占有率;RP-HPLC测定游离小分子药物为(23.20±0.82)%,RSD为3.53%。结论 本实验初步建立了抗体偶联药物抗DLL3单抗-MPVP-PBD的质控方法,该质控方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可作为其常规检测方法,为我国相关抗体偶联药物的质量检测提供了参考依据。
  • 单克隆抗体药物分析方法验证专栏
    亲水相互作用超高效液相色谱法分析单抗N糖谱的方法学联合验证
    王文波, 武刚, 于传飞, 张峰, 王兰
    2019, 54(24): 2028-2033. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.005
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    目的 对亲水相互作用超高效液相色谱法检测单抗N糖谱进行多家实验室的联合验证。方法 依据ICH_ Q2_R1指导原则和2015年版《中国药典》通则9101,开展方法学验证。评价指标包括:特异性、线性、准确性、精密性、定量限、范围和耐用性。结果 验证数据表明,该方法具有良好的特异性、准确性、精密性和耐用性。在100~400 μg蛋白范围内具有良好的线性,r2大于0.98,且回收率在86%~117%内。精密性评价结果显示,该方法整体的RSD值小于10%。该方法的定量限为0.040%,可对在0.040%~78.751%内的单个色谱峰进行准确定量分析。同时多个条件下的耐用性评价结果表明,该方法具有耐用性,峰面积百分比的RSD小于5%,保留时间的RSD小于1%。结论 组织开展的基于亲水相互作用超高效液相色谱法(HILIC-UPLC)的检测单抗N糖谱的方法学联合验证,为《中国药典》标准提高提供方法学验证依据。
    • 综述
  • 综述
    静电纺丝载药纤维及其在经皮递药系统中的研究进展
    叶佩雯, WEI Su-ying, 魏凤环
    2019, 54(24): 2034-2042. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.006
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    静电纺丝技术为载药系统的构建开辟了新方法。载药电纺丝纳米纤维具有与细胞外基质形态结构相近、通气性好和吸湿性强等独特的纤维形貌,尤其适于经皮给药系统的应用。笔者通过归纳分析电纺载药纳米纤维的含义与特点、基质材料选择、制备方法、载药形式与释药特征,及其在经皮递药系统的应用,为电纺纳米纤维经皮给药系统相关研究提供借鉴。
  • 综述
    艾司西酞普兰所致QTc间期延长的研究进展
    陈子木, 袁勇贵, 徐治
    2019, 54(24): 2043-2046. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.007
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    艾司西酞普兰作为一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂,用于治疗抑郁症和焦虑症。近10年来研究表明,艾司西酞普兰可能导致QTc间期延长,诱发心律失常,增加尖端扭转型室速的风险,严重者导致心源性猝死。笔者以“escitalopram/citalopram”“QT prolongation”为关键词,在PubMed上检索近10年涉及艾司西酞普兰延长QTc间期相关文章。总结艾司西酞普兰致QTc间期延长的相关机制、危险因素等。
    • 论著
  • 论著
    基于性状鉴别与DNA条形码联用的鲍氏海马生药学研究
    孙思雅, 来梦茹, 方昀, 葛宇清, 张光霁, 程汝滨
    2019, 54(24): 2047-2054. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.008
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    目的 采用性状鉴别与DNA条形码联用的方法对市售海马药材鲍氏海马(Hippocampus barbouri)进行生药学研究,为其后续鉴定技术开发与应用奠定基础。方法 通过文献结合样品观察总结鲍氏海马的典型性状鉴别特征;提取鲍氏海马样品基因组DNA, 对COI、16S和ATP6基因序列进行扩增和测序,通过MEGA 7分析各序列,计算不同条形码在种内和种间遗传距离的差异,并构建系统进化树,分析不同条形码在鲍氏海马鉴定中的优劣。结果 鲍氏海马的典型鉴别特征包括鼻子有条纹,眼眶内有5条辐射状条纹和尾刺的长短间隔;COI、16S、ATP6序列长度分别为649~650、574和603 bp,不同序列的最大种内遗传距离分别为0.012、0.003和0.003,远小于鲍氏海马与其他海马品种间的最小遗传距离,存在显著的条形码间隔;基于COI、16S和ATP6条形码构建的NJ树结果均显示,鲍氏海马样品单独聚为一个分支,与其他正伪品海马能明显区分,与刺海马的亲缘关系最近,且COI与ATP6构建的NJ树结构更加稳定。结论 基于性状鉴别与DNA条形码联用的生药学研究可获得鲍氏海马的性状和分子鉴定特征,COI、16S和ATP6序列可用于鲍氏海马的后续分子鉴定技术,本实验为鲍氏海马的后续开发和保障海马的药材质量提供了新的技术手段。
  • 论著
    噻吩磺酰胺类膦酸酯衍生物的合成与生物活性研究
    杨家强, 雷延燕, 杨红, 鄢伯钰
    2019, 54(24): 2055-2059. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.009
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    目的 为了寻找抗菌候选化合物,一系列噻吩磺酰胺类膦酸酯衍生物被设计合成。方法 首先,以芳香醛、醋酸铵、亚磷酸二乙酯和Al(OTf)3为反应原料,采用无溶剂一锅法制备中间体Ⅰ;然后,在碱性离子液体OH条件下,中间体Ⅰ与磺酰氯反应制备目标化合物;并采用两倍稀释法对目标物进行体外抗菌活性测试。结果 合成了12个目标化合物,经1H-NMR、13C-NMR和MS确认结构;抗菌活性测试结果显示,该类衍生物对所测革兰阳性菌和革兰阴性菌均有不同程度的抑制活性,尤以目标物Ⅱe、Ⅱk的抗菌活性最为突出,其中前者对金黄色葡萄球菌(S. aureus)、大肠埃希菌(E. coli)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及耐氟喹诺酮类大肠杆菌(MREC)的MIC分别为32、64、32和128 μg·mL-1,后者对S. aureus、E. coli、MRSA及MREC的MIC分别为16、64、32和64 μg·mL-1,抗菌活性明显优于对照药磺胺嘧啶,接近于对照药加替沙星。结论 该类衍生物具有潜在的抗菌活性,值得进一步结构优化和深入研究。
  • 论著
    黄芪ISSR标记遗传多样性及其与主要药用成分的关联分析
    孟祥善, 周玉梅, 代晓华, 刘萍
    2019, 54(24): 2060-2070. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.010
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    目的 为深入研究并充分利用中药材黄芪(Astragali Radix),寻找与有效成分表型性状相关联的分子标记。方法 利用ISSR分子标记技术对43份黄芪进行遗传多样性分析,用13个分子标记结果对供试材料做群体遗传结构分析,并在此基础上用 Tassel 2.1的 GLM对标记与表型性状进行关联分析。结果 43份黄芪间有一定的遗传多样性,遗传距离在0.050 6～0.743 8之间,平均遗传距离0.274 1;来自宁夏和甘肃的人工栽培黄芪与采自宁夏六盘山镇的野生黄芪亲缘关系较近,而No.340与其他黄芪的亲缘关系最远;43份黄芪多糖含量7.693～27.840 mg·g-1,总皂苷含量7.167~17.579 mg·g-1,总黄酮含量2.212~6.164 mg·g-1,甲苷含量6.070 ~107.920 μg·g-1;线性回归分析表明,总皂苷和总黄酮含量呈极显著正相关(r=0.650 5,P=2.3×10-6<0.01),但甲苷与总皂苷含量、与总黄酮以及多糖含量均无显著相关关系。通过群体遗传结构分析43份黄芪划分为4个亚群,以GLM模型分析发现,在P＜0.01水平上,有13个ISSR标记共34个位点与多糖、总皂苷、总黄酮以及甲苷含量4个表型性状发生关联,各标记对表型变异的解释率在8.14%～51.39%。其中高阈值(P＜1×10-5)下与甲苷含量相关联、解释率超过30%的位点有15个;与多糖含量相关联的位点1个,且解释率达到了51.38%。结论 研究结果为黄芪的鉴定、保护及分子标记辅助育种提供依据。
  • 论著
    A30P突变体α-突触核蛋白表达体系的构建及其对蛋白质降解系统的影响
    闫加庆, 苑玉和, 楚世峰, 刘敏, 张元, 曹秀萍, 李国辉, 陈乃宏
    2019, 54(24): 2071-2075. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.012
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    目的 研究A30P突变体α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)对自噬溶酶体途径和泛素蛋白酶体系统的影响。方法 构建稳定表达A30P突变体α-syn的PC12细胞株,通过Western blot、RT-PCR等方法检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-II和p62的含量变化,并观察细胞内泛素化蛋白的改变。最后,通过MTT法检测A30P突变体α-syn对正常和应激条件下细胞活力的影响。结果 成功构建稳定表达A30P突变体α-syn的PC12细胞株。过表达A30P突变体α-syn可降低自噬相关蛋白LC3-II含量,提高自噬底物p62水平,并能促进泛素化蛋白质的聚集。此外,表达A30P突变体α-syn对细胞活力没有显著影响,但在血清剥夺或神经毒剂鱼藤酮刺激下,表达A30P突变体α-syn的细胞活力较空载体组显著降低。结论 过表达A30P突变体α-syn可导致蛋白质降解系统障碍,并提高细胞对外界刺激的敏感性。
  • 论著
    胡柚皮黄酮对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏NLRP3炎症小体的影响
    俞建顺, 陈芝芸, 吴黎艳, 何蓓晖, 严茂祥, 蒋剑平
    2019, 54(24): 2076-2081. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.013
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    目的 观察胡柚皮黄酮(PTFC)对高脂高糖饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠NLRP3炎症小体信号通路的影响,探讨其防治NASH的机制。方法 50只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、PTFC低、中、高剂量组,每组10只,采用高脂高糖饮食喂养16周建立NASH小鼠模型,从造模第5周起予25、50、100 mg·kg-1·d-1 PTFC干预12周,HE及油红O染色观察肝脏组织病理学变化,生化法检测血清CHOL、TG、ALT、AST水平,Realtime-PCR检测肝组织核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Casp1)及白细胞介素(IL)-1β mRNA的表达,Western blot检测肝组织NLRP3、Casp1蛋白的表达。结果 经过16周高脂高糖饮食的喂养,小鼠肝组织NAFLD活动度积分(NAS)显著升高,血清CHOL、ALT及AST水平升高,TG水平下降,肝组织NLRP3、ASC、Casp1及IL-1β mRNA表达明显增强,Casp1蛋白表达明显增加,NLRP3蛋白表达有增高趋势;经过PTFC的干预,小鼠NAS下降,血清ALT、AST水平显著下降,TG水平明显升高,肝组织NLRP3、ASC、Casp1及IL-1β mRNA表达明显减少,NLRP3及Casp1蛋白水平显著降低,以PTFC高剂量组最为明显。结论 NLRP3炎症小体信号通路激活可能参与高脂高糖诱导的小鼠NASH发生发展,PTFC可通过干预该通过防治NASH的进展。
  • 论著
    磺胺二甲嘧啶有关杂质国家标准物质的研制
    杨青, 刘颖, 刘书妤, 田冶, 马步芳, 张夏, 冯艳春, 姚尚辰, 刘万卉, 尹利辉
    2019, 54(24): 2082-2086. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.014
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    目的 介绍磺胺二甲嘧啶有关杂质的国家标准物质研制过程,为提高我国磺胺二甲嘧啶质量控制标准提供保障。方法 首先采用红外、质谱和核磁共振方法,对磺胺二甲嘧啶杂质A、E进行结构确认,然后采用《欧洲药典》(9.0版)磺胺二甲嘧啶有关物质检查方法测定杂质A和E的纯度,同时测定磺胺二甲嘧啶杂质A、E的水分和炽灼残渣含量,应用质量平衡法确定首批磺胺二甲嘧啶杂质A和E国家标准物质的含量。同时还采用外标法和核磁定量方法测定其含量,与质量平衡法相互验证。最后采用标准曲线法测定了磺胺二甲嘧啶杂质A、E对磺胺二甲嘧啶在241 nm检测波长下的校正因子。结果 磺胺二甲嘧啶杂质A、E与《欧洲药典》规定的结构相同,质量平衡法测定杂质A、E的含量分别为99.1%和98.7%,与外标法和核磁定量的结果基本一致,杂质A和E对磺胺二甲嘧啶的较正因子分别为0.97和0.63。结论 建立了首批磺胺二甲嘧啶杂质A、E的国家标准物质。
  • 论著
    2018年中国医院治疗药物监测开展状况调查
    李沭, 张倩, 张爽, 陈文倩, 张相林
    2019, 54(24): 2087-2092. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.015
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    目的 了解国内医院治疗药物监测(TDM)工作开展概况,为学科发展和规划提供指导。方法 对全国医院TDM进行网络问卷调查,包括:基本信息、TDM实验室及临床科室开展情况、监测药品种类及数量、质量控制、报告解读及个体化给药方案制定、审批与管理等共7部分33条问题。进行数据清洗,有效数据纳入统计。结果 共纳入463份有效问卷,其中177家医院开展了TDM工作,具体情况为:学历以硕士(43%)和本科(33%)为主;75%医院建立色谱分析法开展TDM;监测项目主要为血药浓度检测(63%)和药物基因检测(36%);开展科室以神经内科最多。本次共调研11类药物2018年TDM情况,结果显示精神障碍类药物监测品种最多(18个),免疫抑制剂的监测数量最多(57%)。64%医疗机构开展质控。50%医院配套临床解读,75%显示临床药师参与解读;82%根据结果制定个体化方案。65%的医院开展了TDM审核审批制度,47%纳入医院药事管理与药物治疗学委员会管理制度。结论 本次问卷获得了以上7个方面的现状,掌握了11类药物2018年TDM概况,但质控、临床解读、个体化方案制定和TDM管理方面仍存在发展不充分现象,未来TDM工作除了开展药物的检测,还有注重完善和发展以上不足之处,促进临床合理用药。
  • 论著
    基于氟尿嘧啶类药物化疗的异常糖链糖蛋白在胃肠道恶性肿瘤中表达
    印妮, 王雨雯, 唐雨曼, 朱彦博, 王振欣
    2019, 54(24): 2093-2096. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.016
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    目的 了解肿瘤异常糖链蛋白(TAP)在基于氟尿嘧啶类药物化疗的胃肠道恶性肿瘤患者外周血中的表达情况,探讨影响其表达的因素及临床意义。方法 本研究纳入2018年5月至12月病理诊断确诊为胃癌及结直肠癌患者99例,其中氟尿嘧啶联合紫杉醇治疗后的胃癌患者53例,氟尿嘧啶联合奥沙利铂治疗后的结直肠癌患者46例,检测其TAP值,收集患者的基本资料、癌种、分期及血清肿瘤标记物等情况,分析TAP在不同特征消化道肿瘤中的表达差异。结果 TAP在基于氟尿嘧啶类药物化疗的胃肠道恶性肿瘤患者外周血中的表达值为(158.11±33.63),TAP值的表达在不同性别、年龄、癌种、临床分期及血清肿瘤标记物表达情况之间无统计学差异。结论 TAP在基于氟尿嘧啶类药物化疗的胃肠道恶性肿瘤患者中表达无差异,还不能作为鉴别诊断不同特征的消化道恶性肿瘤的依据。
  • 论著
    高层次药学应用型人才培养的思考
    顾洁, 许风国, 甘甜
    2019, 54(24): 2097-2115. https://doi.org/10.11669/cpj.2019.24.017
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    目的 在“健康中国”战略背景下,为我国高层次药学应用型人才培养提供政策建议。方法 从培养规模、培养模式、培养成效3个方面对我国高层次药学应用型人才培养现状开展调查分析;结合政策背景,辨析高层次药学应用型人才培养面临的新挑战;对美日两国学位体系设置及培养模式中的相关举措进行借鉴。结果 应开展药学专业学位认证来促进药学专业学位教育标准化;应坚持职业导向,推动药学专业学位与职业资格的衔接;为满足社会对高层次药学应用型人才的需求,应设置并发展药学博士专业学位。结论 高层次药学应用型人才的培养要走协同性的质量发展道路,实现规模与质量的统一,通过加强药学专业学位质量保障体系建设来培养高端药学人才是实现“健康中国”战略目标的重要基础。