%0 Journal Article %A 武刚 %A 付志浩 %A 杨志行 %A 崔永霏 %A 张荣建 %A 宗伟英 %A 王兰 %T 定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证 %D 2019 %R 10.11669/cpj.2019.24.001 %J 中国药学杂志 %P 2001-2009 %V 54 %N 24 %X

目的 NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法 针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列: CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列: FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL-1~300 pg·μL-1内,线性良好(r2>0.99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均<15%;定量限为3 fg·μL-1;内部参考品 DNA 标定结果为30 μg·mL-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组 DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论 自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主 DNA 残留检测要求。

%U http://journal11.magtechjournal.com/Jwk_zgyxzz/CN/10.11669/cpj.2019.24.001